▶细胞样本裂解方案

贴壁细胞裂解方法

单层贴壁细胞总蛋白的提取：

      1、倒掉培养液。

      2、每瓶细胞加5ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。

     3、按1ml裂解液加10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）

     4、每瓶细胞加400 μ 含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

     5、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）

     6、于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷）

     7、将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于－20℃保存。

悬浮细胞裂解方法

    1. 培养1×10⁶-1×10⁷个细胞；

    2. 将细胞转移到15ml圆形离心管，4?C, 500g离心5min；

    3. 小心去除上清，加入5ml预冷PBS重悬细胞，4?C, 500g离心5min；

    4. 尽可能多的去除上清，小心不要碰到细胞沉淀。

    5. 在上步骤获取的细胞中，加入200ul ProcartaPlex Cell Lysis Buffer。

    6. 吹吸混匀8-10次，冰上孵育5min；

    7. 将所有细胞转移到1.5ml离心管；

    8. 4?C, 14000g（离心机最大转速）离心10min；

    9. 将上清转移到新管中。该上清可立即用于检测或者保存在-80?C。

   10. 按照多因子检测试剂盒操作方法检测。样本孔加入25ul细胞裂解液和25ul Universal Assay Buffer。

可选步骤：

    建议细胞裂解后上清进行蛋白定量检测。我们推荐使用Lowry法蛋白定量检测。建议将所有样本使用预冷的ProcartaPlex Cell Lysis Buffer调整样本蛋白浓度方为4-8 mg/ml。