实验收费标准：

 实验流程：

　  荧光定量PCR实验步骤：

      1、总RNA抽提（枪头和离心管均经过湿热灭菌，无RNA酶）

     ①取匀浆器，加入1ml的Trizol Reagent，置冰上预冷。

     ②取100mg组织，加入到匀浆器中。

     ③充分研磨直至无可见组织块。

     ④13000g离心10min取上清。

     ⑤加入250 μl，颠倒离心管15s，充分混匀，静置3min。

     ⑥4℃下13000g离心8min。

     ⑦将上清转移到一新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀。

     ⑧-20℃放置15min。

     ⑨4℃下13000g离心10min，管底的白色沉淀即为RNA。

     ⑩吸除液体，加入75%乙醇1.5ml洗涤沉淀。

     ⑪4℃下13000g离心5min。

     ⑫将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3min。

     ⑬加入20μl无RNA酶的水溶解RNA。

     ⑭55℃孵育5min。

      2、反转录（枪头和PCR均经过湿热灭菌，无RNA酶）

    ①取一PCR管，加入含2μg RNA的溶液。

    ②加入1μl oligo(dT)15。

    ③用无核糖核酸酶的去离子水补足至12μl。

    ④于PCR仪上70℃保温5min，迅速置冰上冷却。

    ⑤依次加入4μl 5×buffer，2μl 10mM dNTPs，1μl RNA inhibitor和1μl 反转录酶，用枪抽吸混匀。

    ⑥于PCR仪上42℃保温60min，结束后80℃保温5min灭活反转录酶。

      3、定量PCR1）取0.2ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管。2× qPCR Mix 12.5μl7.5μM基因引物 2.0μl反转录产物 2.5μlddH2O 8.0μl2）取0.2ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管。2×qPCR Mix 12.5μl7.5μM内参引物 2.0μl反转录产物 2.5μlddH2O 8.0μl3）PCR扩增预变性 95℃，10min循环（40次） 95℃，15s→60℃，60s溶解曲线 75℃→95℃，每20s升温1℃4、结果处理ΔΔCT法：A=CT(目的基因，待测样本)- CT(内标基因，待测样本)B=CT(目的基因，对照样本)- CT(内标基因，对照样本)K=A-B表达倍数=2-K

 送样运输要求：

1. 样品处理

a) 动物组织：常规组织100mg，脂肪组织，结缔组织，纤维化组织适当增加。将组织剪切成合适大小后（建议组织块长宽高均不大于0.5 cm），然后迅速完全浸泡于5～10倍体积的RNAsolidTM试剂中。（注意：已浸入RNAsolidTM试剂中的组织经平衡一段时间后，可从溶液中取出，切成更小的组织块，再重新放回RNAsolidTM试剂中；有些比较弱的液体渗透性组织如骨头等，不适合用RNAsolidTM试剂进行RNA保护。）

b) 植物组织：新鲜的叶、果肉、种子最少100 mg。将嫩叶，嫩茎组织切成合适的大小（建议长宽高均不大于0.5 cm）后，然后迅速完全浸泡于5～10倍体积的RNAsolidTM试剂中。（注意：某些植物组织天生具有的屏障，如叶子表面的蜡层可阻碍RNAsolidTM试剂的渗透，对于此类组织，通常需破坏这些屏障层以允许溶液的浸透。）

c) 细胞等样本：收集不少于10^6个细胞沉淀（用PBS清洗1-2次），干冰运输。

d) 酵母、细菌等样本：离心弃上清，收集一定量的菌体沉淀，干冰运输。

e)全血：最少1 mL新鲜血液EDTA抗凝管，干冰运输。

f)血清或血浆：最少1 mL，干冰运输。

g) RNA样品： OD260/280为1.8-2.0，浓度≥100 ng/μL，体积≥20μL，干冰运输。

h)cDNA：cDNA原液≥20 μL，干冰运输。


2. 样品保存及运输

加入有RNAsolidTM试剂的样本可在37℃保存1～2天，2天以后部分组织中的RNA会开始降解。室温（25℃）稳定保存1周，不会有明显的RNA降解发生。大部分样品置于RNAsolidTM试剂中，4℃条件下可稳定保存1个月，不会有明显的RNA降解发生。长期存放可先将保存在RNAsolidTM试剂中的样本4℃浸透过夜，然后将RNAsolidTM试剂吸出弃去，再将样本放入-20℃或-80℃长期稳定保存3～5年。

 实验结果展示：

 外包服务流程：